Bu esnada Kanuni Sultan Süleyman'ın Alman seferi (1532) sırasında Andrea Doria'nın Mora kıyılarına saldırması Osmanlıları güç duruma düşürdü. Bunun üzerine Kanuni, Hızır Reis'i İstanbul'a çağırdı ve 1533'te "Hayreddin" adını verdiği Hızır Reis'i Osmanlı donanmasının başına (kaptan-ı derya) atadı.
Osmanlıların Akdeniz’deki denetiminin artması üzerine, Papalık, Venedik, Ceneviz, Malta, İspanya ve Portekiz gemilerinden oluşan bir "Haçlı donanması" kuruldu ve başına Andrea Doria getirildi. Osmanlı donanması ile Haçlı donanması 1538'de Arta Körfezi önlerinde karşılaştı. Haçlıların 600'den fazla gemisi vardı. Bunun 308'i harp teknesi olup, 120'si en büyük oturak gemileriydi. Haçlılar donanmaya on binlerce forsadan başka 60 bin asker bindirmişlerdi. Hayreddin Paşa komutasında ise 122 kadırga ve forsalar dışında 20 bin asker vardı. Toplamı 80 bin kişiyi bulan bir deniz savaşı daha önce hiç görülmemişti. Savaş sonucunda haçlı donanması 128 gemisini kaybetmiş, 29'u da Osmanlı denizcileri tarafından ele geçirilmişti. Hayreddin Paşa hiçbir gemisini kaybetmezken 400 kadar leventi savaşta ölmüştü. Hayreddin Paşa, tarihe Preveze Deniz Savaşı olarak geçen savaşın mutlak galibiyetini Osmanlı Devleti'ne kazandıran Kaptan-ı Derya olarak adını tarihe yazdıracaktı. Bu zafer Osmanlı Devleti’nin Akdeniz'deki egemenliğini pekiştirdi.
Kutsal Roma-Cermen İmparatoru Şarlken, Preveze’nin öcünü almak için 1541'de Cezayir'e saldırdıysa da başarılı olamadı. Bu arada Fransa Kralı I. François, Şarlken'e karşı Osmanlılardan yardım isteyince Kanuni, Barbaros’u Fransa’nın Akdeniz kıyılarına gönderdi. Barbaros, Toulon'da Fransız donanmasıyla birleşerek 1543'te Nice'i aldı (Nice Kuşatması). Ertesi yıl İstanbul’a dönen Barbaros Hayreddin Paşa, 4 Temmuz 1546’da burada öldü, Beşiktaş'taki türbesine