Bir Zamanlar İstanbul oyuncuları yeni kuşağın başarılı temsilcilerinden oluşuyor. Bir Zamanlar İstanbul oyuncu kadrosunda Cihangir Ceyhan (Ali Tuna) ve Alina Boz (Seher Nazar)’un dışında Hüseyin Avni Danyal (Çetin Nazar), Didem Balçın (Fidan Atik), Şebnem Dönmez (Nermin Sencer), Kaan Taşaner (Gökhan Atik), Deniz Celiloğlu (Emin Tuna), Özge Özder (Jale Nazar), Ümit Kantarcılar (Ogün), İpek Karapınar (Özlem Tuna), Murat Daltaban (Kenan Sencer), Nihal Koldaş (Serpil Tuna), Mirza Bahattin Doğan (Külhan) ve Serdar Özer (Celal) gibi tecrübeli isimler yer alıyor.
Bir Zamanlar İstanbul dizisinin diğer oyuncuları ise Gurur Çiçekoğlu (Pusat), Burak Alp Yenilmez (Ömürhan), Atakan Yarımdünya (Demir), Ahmet Kılıç (Jöntürk), Başaran Yavuz (İstifacı Metin), Tezhan Tezcan (Salih), Muhammet Emre Kaya (Hüseyin Amir), Can Kulan (İsot Bekir), Ekrem Düzgünoğlu (Deli Ozan), Selin Genç (Elif), Nazlı Çetin (Tülay), İrem Tuncer (Gökçe), Derviş Tezcan (Merdan), Poyraz Güven (Arda), Muhammet Mert Güzeloğlu (Selim), Ela Şafak (Hülya Atik), Atahan Bülent Çatalbaş (Ilgaz Atik), Ayaz Çoban (Çocuk Ali), Atılgan Gümüş (Vedat Tuna) ve Ahmet Erkut (İlyas Usta).